**产品名称**：pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a质粒 尊龙凯时是一家领先的生物医疗产品供应商。
**产品规格**：0.5 μg质粒干粉

在收到产品后，请根据产品管壁的标签判断产品的形式，并在扩增之前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态及培养温度。

pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a质粒扩增流程

1. **质粒干粉**（常温运输，存于-20°C，保质期90天，请务必进行转化和挑单克隆培养，不要直接使用或测序）
① 在收到质粒干粉后，请先以5000 rpm离心1分钟，然后加入20μl去离子水（ddH2O）以溶解质粒；
② 取1支100μl感受态菌于冰上解冻10分钟，加入2μl质粒后，进行冰浴30分钟，然后在42°C热激60秒，不要搅动，随后再冰浴2分钟；
③ 加入900μl无抗LB液体培养基，180rpm震荡37°C培养45分钟；
④ 以6000 rpm离心5分钟，仅残留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布于目标质粒抗性的LB平板上；
⑤ 将平板正向培养1小时后倒置于37°C培养14小时。如需在30°C培养，则需延长至20小时。如果菌落稀少，则可直接转化10μl质粒。

2. **甘油菌种**（冰袋运输，存于-80°C，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
按照四区划线法挑取单菌落培养，酵母菌需先液体复苏再进行四区划线，最后挑取单菌落进入液体培养。
3. **穿刺菌种**（冰袋运输，存于4°C，保质期7天）
穿刺接种后液体培养，再进行四区划线处理，最终挑取单菌落进行液体培养。

4. **菌落平板**（冰袋运输，存于4°C，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5. **液体质粒**（冰袋运输，存于-20°C，保质期90天）
单独提取的液体质粒在收到后可直接使用。
6. **滤纸质粒**（常温运输，存于-20°C，保质期90天，请务必进行转化和挑单克隆培养，不要直接使用或测序）
收到后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加入100μl无菌水将滤纸浸湿并浸泡5分钟，吸取5μl质粒转化，离心全涂。

提取步骤示例

**实验原理**：碱裂解法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的拓扑学差异进行分离。当pH值介于12-12.5的范围时，线性DNA会发生变性，而共价闭环质粒DNA则保持稳定。在添加高盐缓冲液恢复pH至中性后，质粒DNA重新结合。此后，通过离心可去除染色体DNA及其相关杂质。

操作步骤

1. 准备20ml灭菌培养管并编号，加入8ml LB培养基及8µl相应抗生素。
2. 用10µl枪头挑取单个菌落至培养管中，37°C震荡培养过夜。
3. 取2ml培养液加入离心管，10000 rpm离心2分钟，去上清。
4. 向沉淀中加入250µl Buffer P1（含RNase A），充分混匀悬浮。
5. 添加250µl Buffer P2，混合4-6次，获得澄清裂解液。
6. 加入350µl Buffer N3，旋转混合后离心将形成的沉淀去除。
7. 将上清液转移至清洁的吸附柱，离心1分钟，处理收集管中的液体。
8. 依次添加Buffer PB、Buffer PW，并离心以去除杂质。
9. 最后，加Buffer EB洗脱质粒，并存于-40℃。

**注意事项**：使用前将试剂盒中的RNA酶加入Buffer P1，存于4℃。Buffer EB加热至65-70℃可提升提取效率。了解更多关于质粒载体的信息，敬请咨询尊龙凯时。