## 培养条件

细胞培养的气相要求为95%空气和5%二氧化碳，最佳培养温度为37℃。

### 传代方法

首次传代建议采用1:2比例，传代后的情况可在2天后更换培养液。为了确保细胞在运输过程中的良好状态，建议同时购买并备齐相关培养基，享受非常优惠的价格。收到细胞后，请及时处理，直至细胞状态良好，再将其灌满完全培养液并封好瓶口。

当收到细胞时，需用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将消毒后的细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便细胞适应环境后再进行后续处理。

使用显微镜观察细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的照片以备保存（建议分别拍摄40x、100x和200x的照片）。前三天的照片是重要的售后依据，如未提供照片，将默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

#### a. 细胞传代

如果细胞的融合度未超过80%，需将瓶内的完全培养液转移至离心管，保留5ml培养基，并再次放入37℃、5% CO2的培养箱继续培养。如果细胞的密度超过80%，即可开展传代。贴壁细胞传代的具体步骤如下：

1. 弃去培养上清液，用不含钙、镁离子的PBS缓冲液轻洗细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，并在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞的消化情况。如果细胞大部分变圆并开始脱落，迅速返回操作台，轻轻敲击培养瓶，然后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打使细胞完全脱落后，将悬液转移至15ml离心管，1000 RPM离心5分钟，弃去上清液，加入1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按照1:2的比例将细胞悬液分瓶传代（至两个T25瓶），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放回37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

#### b. 悬浮细胞传代

1. 采用半换液法，可以竖直放置培养瓶在培养箱静置约1小时，轻轻吸出约3ml的培养基，再补充3ml的完全培养基。如果培养基变色较慢，可直接加500ul FBS，传代时可直接补充5ml培养基，并分为两个培养瓶进行培养。一般情况下，经过此方法传代3次后可进行一次离心传代，以去除死细胞。
2. 采用离心换液法，如需分瓶可将细胞悬液收集到离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清液，加入1-2ml培养液后重悬混匀，将细胞悬液按照1:2的比例转移至新的T25瓶中，添加6-8ml配置好的新的完全培养基，以保持细胞的生长活力。后续传代视实际情况按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 向培养瓶中添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞状态，待细胞回缩并变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清液后，沉淀的细胞需加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若后期要将细胞转入液氮罐中，需在-80℃冰箱中存放至少24小时后再转入液氮罐中。

### 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（记得佩戴防护面具），迅速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无冰晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含有5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，使用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天，需更换为新鲜的完全培养基，继续培养。

### 注意事项

部分细胞在运输过程中可能会因贴壁不牢而出现脱落，这是正常现象。如果脱落较多，可将培养瓶中所有的培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清液作为过渡培养液（后期可用于对比培养），沉淀后加入1-2ml胰蛋白酶，轻轻吹打并重悬，消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基终止反应。然后再进行离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基进行重悬，最后按照1:2比例分瓶传代（至两个T25瓶），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，再次放入37℃、5% CO2的细胞培养箱内。

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